Nick Daley travaille l’été comme gardien de nuit au Museum d'histoire naturelle de New York. Pour ce lycéen qui suit les traces de son père Larry (l’ancien gardien du musée incarné dans les films par Ben Stiller), ce poste représente un vrai défi car il est déterminé à ne pas le décevoir. Heureusement pour lui, il connaît bien la tablette qui donne vie aux mannequins exposés. Dès la tombée de la nuit, il peut ainsi retrouver ses vieux amis Jedediah, Octavius et Sacagawea. Mais lorsque le dangereux souverain égyptien Kahmunrah s'échappe du système dans le but de délivrer son armée de morts du monde souterrain, Nick doit tout mettre en œuvre pour contrer ses plans diaboliques et ainsi sauver le musée une fois pour toutes.

Ben Stiller réendosse le rôle de Larry, le gardien de musée le plus survolté, dans le dernier volet de la saga La Nuit au Musée. Il quitte pour Londres où il va vivre sa plus grande aventure. Accompagné de ses amis le Président Roosevelt, Attila, le Romain Octavius, Jedediah et le pharaon Ahkmenrah, ainsi que de nouveaux personnages délirants, il va tenter de sauver la magie avant qu’elle ne disparaisse à tout jamais.

Le plus grand musée du monde vient d'accueillir de nouvelles expositions, et parmi elles, l'ancestrale tablette des pharaons aux pouvoirs magiques. Désormais la nuit, toutes les animations du musée prennent vie, y compris le maléfique pharaon Kahmunrah et ses acolytes Al Capone, Ivan le Terrible et Napoléon. Le gardien de musée Larry et ses vieux amis le Président Roosevelt, Attila, T-Rex, le romain Octavius et Jedediah le cowboy vont devoir livrer une bataille acharnée et délirante contre ces animations malintentionnées.

Le Muséum d'Histoire Naturelle renferme dans ses murs un secret mystérieux et stupéfiant que Larry, nouveau gardien de sécurité, ne va pas tarder à découvrir avec affolement : la nuit, toutes les expositions prennent vie ! Sous ses yeux, les soldats romains et les cow-boys miniatures se lancent dans une guerre acharnée, Attila et ses Huns commencent à piller les expositions avoisinantes, la momie tente de sortir de son sarcophage, le squelette du redoutable – mais néanmoins attachant – tyrannosaure rôde dans les couloirs... Le chaos est total ! Larry pourra-t-il remettre de l'ordre dans ses collections et sauver le musée ?